青霉素酰化酶技术工艺发展趋势分析

第一节 产品技术发展现状

青霉素酰化酶（penicillin acylase）在医药工业发挥着重要的作用，它能够水解青霉素产生6-氨基青霉烷酸（6-APA），6-APA是合成青霉素的关键中间体。青霉素酰化酶又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。该酶由2个亚基组成：20～23kDa的含有侧链结合位点的亚基和65 69kDa的含有催化位点的亚基。

目前应用最多的是由大肠杆菌和巨大芽孢杆菌产生的青霉素酰化酶。

近年来的 研究 倾向于3个方面：利用物理或化学诱变方法、基因工程方法对产青霉素酰化酶的菌株进行改造，突变菌种的分离以及酶在不同的产酶宿主细胞中的克隆和表达。如利用紫外光诱变巨大芽孢杆菌可以获得酶产量增加4 倍的突变菌株，利用重组DNA技术将编码青霉素酰化酶的基因导入宿主细胞中，构建了高产分泌型工程菌。

我国从70年代就 研究 和开发将青霉素酰化酶用于半合成抗生素的生产中，但是，到目前为止，除了6-APA的生产外，其他产品均未能实现工业化。国外虽然有厂家（如DSM）在β-内酰胺抗生素生产的全过程均实现了酶法生产，但是由于对我国实行的技术封锁，我们拿不到核心技术，有的国内厂家专门靠进口母核及侧链来发展β-内酰胺抗生素，制备母核用的固定化酶也从国外进口。

目前，国内的青霉素链条的发展非常不均衡，虽然我国青霉素工业盐有巨大的产能，但是合成中间体的技术还比较落后，在6APA、7-ADCA和GCLE三个中间体链条中，我国6APA技术已经相当成熟，年产量在4000吨以上，能够满足国内需求；7-ADCA的技术则相对落后，一直是国内中间体发展的瓶颈，年产量约300吨左右。

第二节 产品工艺特点或流程

1、青霉素酰化酶的生产方法

青霉素酰化酶产生菌菌种的改良

青霉素酰化酶产生菌菌种改良的任务是提高野生型菌种的产酶能力和酶活力，减少β-内酰胺酶的产生以及弱化或消除不利于青霉素酰化酶工业化应用的因素。通常对青霉素酰化酶产生菌进行菌种改造的手段有诱变、定点突变和利用基因工程改良菌种。

DNA重组技术生产青霉素酸化酶

利用DNA重组技术将编码青霉素酰化酶的基因转移到合适的宿主菌中构建高产和分泌型产生菌，可以弥补原产生菌的生产缺陷。若同时采用高

密度培养技术，还可以提高分泌产物青霉素酰化酶的比生产率和酶活力。

目前，国内外关于PGA的基因工程 研究 大多基于大肠埃希氏菌的PGA基因（pga），还有一些关于巨大芽孢杆菌、粪产碱菌、嗜柠檬酸克吕沃尔

氏菌、香氏普罗威登斯菌PGA基因遗传 分析 的报道。

不同来源的pga基因，其表达调控方式不同。大肠埃希氏菌PGA的基因调控是一个较为复杂的系统，PGA的表达是温度敏感性。受细胞生长速

率的影响，且受葡萄糖阻遏和苯乙酸诱导。野生型大肠埃希氏菌PGA的表达受到包括转录、蛋白质翻译、转位和胞质加工在内的各步限制，不适合直接用于DNA重组，可以通过改变野生型大肠埃希氏菌pga基因的调节区域的某些碱基，同时增加核糖体结合位点与ATG启动密码子之间的距离，来提高pga基因的表达量。大肠埃希氏菌胞质PGA的分泌过程需要一定量的伴随蛋白SECB参与PGA前体蛋白的穿膜输送和蛋白质折叠。伴随蛋白的大量生成有助于胞质PGA的积累。

不同的表达系统对外源pga基因的表达产物会产生一定的影响。在构建重组PGA产生菌时较多选择的是大肠埃希氏菌表达系统，其次是枯草芽孢杆菌表达系统和啤酒酵母表达系统。此外，质粒的拷贝数首先取决于自身的遗传特性，同时还受到宿主菌生理状况及生长环境的影响。

利用基因工程菌及发酵方法生产青霉素酰化酶

工业化生产PGA主要采用大肠杆菌和巨大芽孢杆菌，虽然经过复杂的诱变育种，仍存在产酶水平较低、变温发酵和需要苯乙酸诱导等缺点。目前，国内外 研究 者都在利用基因重组技术将PGA基因克隆并在大肠杆菌或芽孢杆菌中表达，以期大幅度提高PGA的产量和简化生产工艺。

整体来说，青霉素酰化酶的生产过程可以按照酶下面的流程：

青霉素酰化酶的生产过程

大肠杆菌发酵生产青霉素酰化酶

重组大肠杆菌发酵培养基主要成分是酵母粉，其含量一般为3%。重组菌只需少量的供氧即能产生较高的青霉素酰化酶活性。当装液量少时。

氧气供应充足，菌体生长速度快，对青霉素酰化酶活性表达不利。菌体在不同的生长阶段，利用培养基中提供的营养物质，同时产生有机酸或氨基氮。苯乙酸浓度随培养时间延长逐渐下降，苯乙酸在青霉紊酰化酶合成中具有诱导作用。维持或延长培养液中的最适苯乙酸浓度，可提高酶的活性和产量。

芽孢杆菌发酵生产青霉素酰化酶

与重组大肠杆菌系统相比，重组枯草杆菌系统具有较强的表达蛋白后加工能力，产物能够分泌到胞外，从而有利于目标蛋白的分离和纯化。重组枯草杆菌生产PGA可以采用各种不同的表达系统，这些系统中，有些需要昂贵的IPTG诱导表达，有些则将PGA基因克隆到一个表达质粒中，由于质粒的不稳定性将影响PGA的表达。

巨大芽孢杆菌PGA在大肠杆菌中表达只能停留在细胞周质空间，无法分泌到培养基中，不利于后续的分离，而且表达量也太低，没有实用价值。

枯草杆菌则具有极强的分泌能力，加上它与巨大芽孢杆菌同属革兰氏阳性菌，PGA基因原来的SD序列也能在枯草杆菌中很好地起作用，表达的效果就好得多了。产青霉素G酰化酶的温度诱导型重组枯草芽孢杆菌发酵条件的 研究 结果表明，最佳诱导时机是细胞对数生长的中后期，诱导前应将PH调节至中性；最佳诱导条件为升高温度至50℃并维持4rain随后将温度降低到34℃进行重组蛋白的表达。在上述条件下，PGA的表达水平较高。SDS-PAGE电泳 分析 表明该重组菌能够将绝大部分表达的PGA分泌到细胞外，而且表达的PGA蛋白占有高比例（90%）。

重组青霉素G酰化酶基因工程枯草杆菌株和巨大茅孢杆菌相比，具有表达量高，发酵条件简单等优点。

2、青霉素酰化酶的提取方法

如何收纯化青霉素酰化酶，尤其是使用大肠杆菌作为基因工程菌的时候。是个很关键的步骤。也是直接影响青霉素酰化酶质量的一步。

声破碎层析提取纯化法

超声破碎层析提取纯化法超声破碎层析提取纯化所有纯化步骤均在O-4℃左右操作，包括以下的一些基本步骤：无细胞提取液的制备、硫酸铵分段沉淀、DEAE-Sephadex A-50柱层析、DEAE-纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤和羟基磷灰石柱层析。利用大肠杆菌作为基因工程菌，文献报道多采用超声波法提取，该法得到的粗酶液比活低，一般要经过四、五步纯化才能得到较高比活的酶液。

渗透压冲击法

渗透压冲击法提取青霉素酸化酶，得到的粗酶液比活高，只需经过硫酸铵沉淀一步纯化就能得到较高比活的酶液，且能直接用于固定化。大肠杆菌青霉素酰化酶属于胞内酶，存在于细胞的细胞膜与细胞壁之间，大肠杆菌为细胞壁较脆弱的G菌，待提取的酶存在于周质空间，将菌体置于高渗液中，使之被高渗液饱和，再将被饱和的菌体突然放入低渗介质中，由于渗透压的作用，细菌细胞壁被部分撑破，酶释放到胞外。这样就避免了全破碎细胞造成的内容物过多释放。比活过低的问题，同时提取过程在较低温度下进行，有效地保持了渗出酶的活力，提高了酶的比活，是超声波法的10倍以上，因此只需硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose-52柱层析就能得到聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单带的酶。渗透压冲击法提取青霉素酰化酶不需复杂的设备，宜放大，采用此法一次处理发酵液菌体，得到较好的结果。实验证明，提取细胞壁较脆弱的G茵的胞内酶，渗透压冲击法是一种快速得到高比活粗酶液的有效方法。

吸附剂法

纯化发酵液中的青霉素酰化酶。方法采用吸附纯化法。硅藻土经氢氧化铵处理后可用于从发酵液中直接提取青霉素酰化酶。此法可在常温下操作，酶活力收率较高，具有潜在的工业应用价值。提取青霉素酰化酶的第一步收集菌体丝。菌体的收集主要是离心法，由于细菌细胞很小，难于沉降，离心法能耗很大。采用絮凝技术收集菌体简单经济，但菌体收集不彻底。采用絮凝剂与离心相结合的方法，大大缩短离心时间，既不丢失菌体，又提高了单位时间内处理发酵液的量，降低能耗，为青霉素酰化酶工业化生产提供了一定的依据。

中空纤维膜分离法

用传统的硫铵法分离青霉素酰化酶不仅收率低，而且得到的浓缩酶液含有大量的硫酸铵，需要多次透析脱盐才能用于制备固定化酶。超滤法是近年来酶制剂工业所采用的一种新的浓缩技术，虽然大大提高了酶的提取水平，但由于膜品种多，质量不稳定，孔径分布广等原因，影响了其推广应用。故选择合适的超滤膜是此技术中决定其收率的一个关键部分。使用聚砜中空纤维超滤膜分离青霉素，操作时将青霉素酰化酶溶液注入储槽中，在蠕动泵提供的动力下，溶液经精滤后进入超滤膜中，一方面溶液中的小分子物质经中空纤维的内壁渗透出来成为超滤液而排出，另一方面溶液中的酶蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，返回到储槽中。如此反复循环，直到达到规定的浓缩要求为止。超滤方法是一种物理变化的操作，不会引起物料的相变化，因此在操作过程中，酶的活性不会遭到破坏。且浓缩和提纯可同时进行，非常适用于大规模的连续工业化生产。

新型的分离方法

用反胶束溶液提取大肠杆菌青霉素酰化酶

青霉素酰化酶积累在细胞的周质空间内。对于整体细胞破碎的缺点就在于酶会被细胞的其他物质所污染。反胶束技术被用来提取分子量从6KD到

100KD的许多蛋白质和酶，对他们活力的损害很小。经过二-（2-乙基已基）硫代琥珀酸钠（A（Ⅺ）稳定的水一已烷粗乳状液和细乳状液可选择性地改变大肠杆菌细胞通透性，用于提取青霉素酰化酶。就该酶的收率和纯化比较了各种有机溶剂和表面活性剂的作用。酶的回收率比超声波处理方法高，而且酶的比活较高。酶可以溶解在表面活性剂在极性有机溶剂中形成的反胶束的核心。

两步色谱纯化法

大肠杆菌超声处理经过过滤后使用两步色谱纯化法是一个有效的分离纯化方法。获取步骤第一步包括使用Cu2+作为金属离子的固定金属亲和力色谱。该方法包含了两步洗涤步骤：1MNH，a和0.01M眯唑。酶活回收率可以达到90%以上。第二步是流水相互作用色谱。能够回收酶活性的

77%。相比初始的酶粗提液，整个步骤可以纯化酶66倍，回收酶活性的70%，在整个操作过程中无需外加步骤整个操作过程PH值基本保持在7左

右，是适合青霉素酰化酶活性pH。

集成回收纯化法

该法是直接从大肠杆菌组织匀浆或者粗提液里将非酶蛋白质用四聚铵盐沉淀，然后使用拟亲和环境下用Amp-Seph吸附。添加四聚铵盐对沉淀颗

粒的大小有直接影响。在室温下往酶溶液里先后加入22%（w/v）的硫化铵和1%（w/v）的四聚铵盐可以增加青霉素酰化酶的活性。在实验条件下，青霉素酰化酶的回收率达到86%。这一集成体系可以同时进行细胞碎片和沉淀颗粒的过滤。将吸附在Amp—Seph上的青霉素酰化酶洗脱下来，活力较高，洗脱效率达95%。

第三节 国内外技术未来发展趋势 分析

青霉素酰化酶为可逆酶，一般在碱性条件下催化青霉素水解成为6-APA 母核和相应的酰基侧链，而在酸性条件下可以催化6-APA 母核和酰基侧链的缩合反应。近年来，青霉素酰化酶的发展主要是在以下2个方面：一是运用基因工程的方法寻找该酶的高产菌株和性能优良菌株；二是探索新的高效的固定化方法，提高酶活力和利用率，改善酶的特性。

青霉素酰化酶具有广泛的市场应用前景，青霉素酰化酶已有效地应用于半合成β内酰胺抗生素的生产、肽的合成和外消旋混合物的拆分中。随着酶技术的不断发展，青霉素酰化酶在固定化技术、非水相介质酶催化技术及定点突变技术等方面取得了一定的发展，而且 研究 者不断采用基因工程方法筛选产青霉素酰化酶的高产优质菌株。青霉素酰化酶在基因工程和酶工程方面的不断发展，将使其在医药、食品、中间体合成等领域的应用逐步扩大。

目前，世界上抗菌药的主力军仍然是青霉素类和头孢菌素类抗生素。新型的广谱、长效、口服且无毒副作用的半合成青霉素类和头孢菌素类抗生素被不断地研制开发出来。在未来几十年里，人类对制造这些半合成抗生素的重要中间体-6-APA需求会不断增长，青霉素酰化酶的应用技术将越来越成熟。 研究 青霉素酰化酶的生产和分离方法具有很重要的意义。随着该酶的其他重要性质被逐步开发出来，青霉素酰化酶将为人类做出更大的贡献。


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